对塑料污染的研究表明，这种威胁对我们星球的危险程度正在与日俱增。海洋是绝大多数塑料垃圾的最终目的地。聚苯乙烯是热塑性聚合物中使用广泛的塑料之一，也是环境中观察到的塑料碎片的主要成分之一，它可用于食品服务和食品包装，因此可以直接包含在食物链中。在这项研究中，在胚胎期注射20纳米大小的聚苯乙烯颗粒（PS）的斑马鱼在没有塑料暴露的环境中生长，在形态、分子和代谢组学水平上研究聚苯乙烯颗粒对其后代胚胎/幼鱼的影响。

1.材料和方法
1.1斑马鱼饲养和PNP处理
试验中使用斑马鱼，总共300个胚胎，每次复制100个胚胎，注射聚苯乙烯纳米塑料（PNP）。此外，用注射超纯水的胚胎作为对照组。将注射的和对照的胚胎保存在胚胎培养基和28.5度的培养箱中直到第6天。从第6天开始，幼鱼被带到系统中的特殊幼鱼槽中，并用特殊的幼鱼饲料喂养到第15天。从第15天开始，每天给它们喂食并生长6个月。直到6个月，注射PNP的斑马鱼的存活率与对照组相比没有观察到显著差异。从对照组和注射组中随机选择10只雌性和20只雄性6个月大的斑马鱼，将它们放入繁殖池中，每个繁殖池中有2只雄性和1只雌性。每组至少获得700个胚胎用于每次复制。将后代胚胎取入E3胚胎培养基中，观察至第120小时。每24小时记录一次所有后代斑马鱼的存活率、孵化率和身体异常。

1.2心跳、血流和运动活性测定
对于心跳和血流分析，从对照组和PNP治疗组中随机选择10个120小时胚胎，在显微镜下进行180秒的视频记录。视频聚焦于心脏的心跳和尾静脉的血流，然后转移到诺达思的斑马鱼微视行为分析系统进行分析。所有实验分三个重复进行。对于运动活性，从对照组和PNP处理组中随机选择24只幼鱼，每只120小时，将其放置在24孔板上，每个孔中有一只幼鱼，并将板放置在诺达思的斑马鱼行为轨迹跟踪系统中。在驯化30分钟后，将该系统调节至10分钟间隔的黑暗和光明期50分钟。在分析期间，通过动物运动轨迹跟踪系统评估幼鱼的运动活动。对每组进行三次重复的72只幼鱼进行分析。

1.3全程免疫荧光幼鱼染色
为了研究亲代PNP暴露对后代自由基形成、细胞凋亡和脂质积累的影响，将达到120小时的新一代幼鱼作为整体免疫荧光进行分析。

1.4代谢组学
将来自对照组和PNP组的25个120hpf胚胎汇集在1ml微量离心管中（每组10个）。加入1ml甲醇以维持均化过程。之后，将提取物置于水浴中超声处理约10分钟。最后，将所有样品以离心10分钟。将上清液轻轻转移到另一个微型离心管中，并在真空下抽吸直至干燥。通过100μl流动相（去离子水：乙腈，包括%0.1甲酸）对样品进行重组。

2.结果和讨论
根据本研究获得的结果，观察到与对照组相比，亲代PNP暴露导致下一代幼鱼的总体畸形（包括心包水肿、卵黄囊水肿、身体畸形/弯曲体轴）显著增加（图1 a和b段）。与注射胚胎（父母）相比，在后代幼鱼中观察到的畸形率低于在注射幼鱼中观察的畸形率（图1b段）。同样，观察到亲代PNP暴露会增加下一代幼鱼的死亡率（图1c），但考虑到注射的胚胎（亲代），观察到下一代幼体的存活率高于注射PNP的胚胎（父母）。另一方面，与对照组相比，孵化率没有差异（图1d）。PNP组的心包区域明显增加（图1e）。这种增加支持了观察到的心包水肿。

图1

在PNP组中观察到眼睛大小和身体长度显著减少（图1f和g）。虽然已经确定亲代PNP暴露会导致后代幼鱼的血流量和心率增加，但根据运动活动的结果，观察到它会导致黑暗期的运动减少（图1h–k）。另一方面，根据整株免疫荧光幼鱼染色结果，亲代PNP暴露导致下一代幼鱼的细胞死亡和自由氧自由基数量增加（图2）。另一方面，由于脂质代谢的不规则性，检测到脂质积累显著减少（图2）。

图2

在本研究中，为了阐明在胚胎早期暴露于PNP的斑马鱼后代中观察到的这些形态学、生理学和分子损伤的潜在机制，通过化学计量分析评估Q-TOF MS/MS光谱来进行代谢组分析。在图中，各组之间存在一定差异（图3a段）。图3b中，有两个主要集群，发现对照组和PNP组之间存在显著差异。这些代谢物可能因投影变量（VIP）得分而显著变化（图3c段）。在图3c中，下调和上调的代谢物分别被阐明为红色和蓝色。根据分析结果，确定酪氨酸、不饱和脂肪酸代谢、叶酸生物合成和精氨酸-脯氨酸代谢受到严重影响（图3d）。

图3

代谢组结果表明，与多巴胺合成密切相关的3-甲氧基酪胺（3-MT）和高香草酸（HVA）水平在PNP组中显著上调（图3c）。3-MT是多巴胺的主要代谢产物，而HVA是多巴胺分解代谢的主要代谢物。两种化合物水平的共同增加表明，这可能是与RET原癌基因、多发性内分泌肿瘤类型、Von Hippel-Lindau和整合膜蛋白相关的几个基因发生遗传突变的迹象。较低的多巴胺水平和诱导分解代谢机制可能导致神经系统疾病。此外，研究表明，多巴胺在肿瘤组织中的浓度低于良性组织，甚至通过多巴胺治疗可以减少慢性应激介导的血管生成，从而阻止肿瘤细胞增殖。

甲基糖胺（creatin），与生物体内的许多过程有关，包括生理、神经、免疫和代谢，被确定为PNP组中具有最高显著性的上调代谢产物（图3c）。高肌酸水平是肾/肌肉疾病和肾功能障碍的标志。此外，这种肌肉废物可能导致血管损伤和高血压。当评估高血流量和心率以及高肌酸水平时（图1和图3），我们可以说父母PNP暴露显著影响下一代。

为了在分子水平上评估这些癌症相关代谢物水平的变化，对幼鱼进行组织病理学和免疫组织化学（使用JNK、NOP10、PI3和H2A.X生物标志物）分析，并搜索癌症结果。根据组织病理学结果，在PS组的幼鱼中发现了严重的神经元变性和坏死，特别是在脑组织中，以及血管中具有核多态性的非典型、深染、增生细胞（图4）。另一方面，根据免疫组织化学分析结果，在PS组幼鱼中检测到显著更高的免疫阳性率，特别是在脑组织JNK和H2A.X表达中，以及在血管中检测到的非典型细胞中NOP10和PI3表达中（图4）。研究表明，JNK与恶性转化和肿瘤生长有关。另一方面，据报道，NOP10的表达水平在肿瘤组织中显著增加，是转移形成的重要标志物。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶是一种重要的酶，在细胞生长、增殖、代谢活性、存活和血管生成中发挥作用。涉及该酶的病理激活涉及多种机制，如肿瘤抑制基因的突变和失活。此外，PS组H2A.X免疫阳性率增加也是DNA损伤的重要指标。在PS组中观察到的神经元损伤和JNK表达也可以被评估为细胞凋亡增加的指标。氧化应激和随后由于抗氧化防御系统不足而导致的自由氧物种增加所引起的不可逆损伤将导致细胞凋亡增加。因此，根据全身免疫荧光幼鱼染色的结果（图2），在PNP组中观察到的细胞死亡和自由氧自由基数量的显著增加支持了这些发现。尽管这些不足以直接诊断癌症，但它们提供了支持癌症发现的重要初步信息。

图4

至于下调的代谢产物，在PNP组中检测到的低肌苷一磷酸（IMP）水平与能量代谢失调有关，可能解释生长迟缓导致的眼睛大小、身体长度和运动活性的差异。PNP组的亚油酸、油酸和二十二碳六烯酸水平显著较低。这些分子被称为不饱和脂肪酸（UFA），在细胞膜中发挥重要作用，用作能量储存，并参与基因表达和蛋白质合成。胆固醇是脂质组织最重要的调节因子之一，是PNP组中另一种显著下调的代谢产物。当将这些发现与全株免疫荧光幼鱼染色分析的脂质积累结果一起评估时（图2），我们可以说，亲代PNP暴露会导致下一代脂质代谢恶化。

3.结论
父母接触聚苯乙烯纳米塑料会导致下一代幼鱼生长迟缓，包括畸形、存活率下降、心率和血流量增加，以及眼睛大小、身高和运动能力下降。根据全山免疫荧光幼鱼染色的结果，注射PNP的斑马鱼新一代幼鱼的细胞死亡和活性氧物种显著增加，而脂质积累减少。根据代谢组学结果，检测到了OPLS-DA分析提出的28个注释代谢组。此外，还发现新一代幼鱼的组织病理学表现和JNK、H2A.X、PI3和NOP10的免疫阳性率显著增加。总之，研究表明，即使仅在胚胎期暴露于PS，也可能影响下一代许多与癌症相关的过程。

参考文献
Sulukan E, Şenol O, Baran A, et al. Nano-sized polystyrene plastic particles affect many cancer-related biological processes even in the next generations; zebrafish modeling[J]. Science of The Total Environment, 2022, 838: 156391.


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